在進行定量PCR實驗時，實驗數據中的C t值是至關重要的。今天將帶您了解 Ct值在 qPCR 中的關鍵作用、及其計算方式和分析統(tǒng)計方法。
C t值多重名稱
在我們深入解釋什么是 Ct 值之前，我們想花點時間強調一下，多年來該值已被賦予多個名稱，包括：
C t – 閾值循環(huán)
C p – 交叉點
TOP——起飛點
C q – 量化周期
這些值都是一樣的，只是名稱不同。為了規(guī)范qPCR的命名法，一般標準實驗中會使用Cq值。
什么是 C q值？
定量PCR實驗通常用于量化目標序列的絕對量或比較樣本之間目標序列的相對量。該技術通過放大過程中發(fā)出的目標特異性熒光信號實時監(jiān)測目標的擴增。
盡管實時熒光定量PCR中， 熒光染料和探針 應該是序列特異性的，但在大多數實時 PCR 實驗中會出現(xiàn)大量的背景熒光。通過閾值線和 C t值可以輕松分析背景中的熒光信號，了解 PCR的循環(huán)周期。其實，所謂的閾值線是檢測水平或反應達到高于背景水平的熒光強度的點。在進行 PCR 之前，您（或您的 PCR 儀中的軟件）設置了一個閾值水平。這實際上是圖表中的一條線，代表高于背景熒光的水平，它也在指數階段開始時與反應曲線相交（圖 1）。
C q值是您的樣品反應曲線與閾值線相交處的 PCR 循環(huán)數。該值表明從您的樣本中檢測到真實信號需要多少個周期。實時 PCR 運行將具有每個樣品的反應曲線，因此會有許多 C q 值。您的 PCR 儀軟件會計算 每個樣品的 Cq值并繪制圖表。
(實時 PCR 擴增曲線上的閾值水平和 C q 值)
C q 值與樣本中目標核酸的數量成反比，并與樣本中的目標拷貝數相關。較低的 C q值（通常低于 29 個循環(huán)）表示大量的目標序列。較高的 C q 值（超過 38 個循環(huán)）意味著較低的目標核酸量。高 C q值也可能表明目標或 PCR 設置存在問題，如本文后面的陷阱部分所述。
您的 PCR 儀器將在每個循環(huán)中收集熒光數據。大約 15 個循環(huán)后，您將對背景熒光水平有一個很好的了解 ——這將顯示為一條從零循環(huán)點開始的直線。閾值水平將剛好高于此水平，但在您的樣品開始進入 PCR 擴增指數階段時。今天，計算機軟件可以計算出這個確切的點，所有現(xiàn)代實時循環(huán)儀都有一個自動閾值線設置。
實時 PCR 記錄反應過程中發(fā)出的熒光量，此時所有 PCR 成分都非常豐富。這樣，C q 值通常在實時 PCR 中的重復之間保持一致。當達到 PCR 反應終點時，積累的抑制劑、失活的聚合酶和限制性試劑會在終點值上產生很多變化，這就是傳統(tǒng) PCR 無法定量使用的原因。
影響Cq值的相關因素有哪些？
許多因素會影響您的 C q 值。 您的樣品之間C q 值的一些差異將是由于生物事件，例如您的目標基因響應治療而上調/下調。然而，C q 值同樣容易受到 PCR 反應準備和 PCR 組分本身的影響。比較常見的是以下幾種情況：
1. 主混音
溶液中的 pH 值和鹽濃度會影響熒光發(fā)射。熒光發(fā)射的任何變化都會自然地改變您的 C q值。因此，請確保您只使用高質量的 PCR 組件，如果使用自制溶液，請在每次實驗前檢查 pH 值并監(jiān)測鹽沉淀。
2. 被動參考染料
反應值是您的 FAM（報告基因）染料與您的 ROX（被動參考）染料的熒光比率。假設 FAM 熒光不變，較低量的 ROX 會產生較高的反應值。
3. 反應效率
PCR 反應效率取決于預混液性能、引物的特異性、引物退火溫度和樣品質量。一般來說，90% 以上的 PCR 效率是可以接受的。* 的 PCR 效率表明感興趣的目標序列在每個循環(huán)中加倍。 PCR 效率與模板 10 倍稀釋之間 3.3 個循環(huán)的變化相吻合。
要確定每個引物對的 PCR 效率，請使用五個 10 倍稀釋步驟對模板進行系列稀釋，并計算 R 2 ，這是一種描述一個值預測另一個值的統(tǒng)計量度。對于接近 100% 的 PCR 效率，您的 R 2 值應大于 0.99。
對標準曲線上的每個點至少運行三個重復。對于低拷貝數輸入，更高的重復數尤其重要，因為重復數之間的變化更有可能發(fā)生。
4. 其他問題
假設您已經排除了上述 3 個因素，導致 C q 值晚的常見原因可能是：
模板太少 - 嘗試使用更多模板。
次優(yōu)的核酸分離——考慮您的核酸分離方案，量化您的 DNA，運行瓊脂糖凝膠，嘗試其他方案/ 試劑盒。
cDNA 合成過程中逆轉錄酶活性較差——逆轉錄酶對降解敏感。訂購一個新的。
RNA/cDNA 降解——保持您的工作空間清潔，改善您的RNA 處理行為 ，避免 cDNA 的多次凍融循環(huán)。
PCR抑制。
另外，其他原因也同樣會影響定量PCR 的Cq值，包括細胞系/培養(yǎng)物中的感染或污染，但這些問題通常在核酸分離之前被發(fā)現(xiàn)。更多PCR相關問題可以進入蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司進行咨詢或留言。
