1、 生長培養(yǎng)好的試驗材料（一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片）
2、 在擬南芥開花前取樣（30片葉子左右即可）
3、 切取葉片為0.5-1mm的細條（如果材料能達到每克107個原生質(zhì)體， 10-20片葉子需要5-10mL酶解液）
4、 迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中，要求全部浸沒。
5、 黑暗條件下抽真空30min。
6、 連續(xù)酶解，室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、 利用光學顯微鏡檢查原生質(zhì)體（30-50μm大小）
8、 在過濾前加入等量的W5溶液
9、 洗干凈濾網(wǎng)，并用W5潤濕，之后過濾
10、 離心100g，1-2min沉淀原生質(zhì)體，盡可能吸走上清，重復洗2 次
11、 重懸原生質(zhì)體于W5中，保持在2*105個 /ml，冰浴30min。
12、 100g離心2min，盡可能吸走上清，利用MMG重懸，濃度約 2*105個/ml
13、 加入10μL質(zhì)粒（1000ng-2000ng ）于2ml離心管中
14、 加入100μL原生質(zhì)體（2*104個），輕輕混勻。
15、 加110μL PEG solution，輕彈使充分混勻
16、 23℃室溫孵育30min。
17、 加400-440μL W5混勻，終止反應
18、 100g，2min 23℃離心，去上清，重復洗一次
19、 用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、 20-25℃孵育16h以上
21、 取樣制片觀察
溶液配制：
1、 酶解液的配制（20ml）
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| MES | 20mM | 0.08528 | KOH調(diào)pH5.7 |
| D-Mannitol | 0.4M | 1.45736 | |
| KCl | 20mM | 0.02982 | |
| macerozyme R-10 | 0.40% | 0.08 | |
| Cellulase R-10 | 1.50% | 0.3 | |
| 55℃水浴10min，待冷卻后再加以下試劑 | |||
| CaCl2·2H2O | 10mM | 0.029402 | |
| BSA | 0.10% | 0.02 | |
| W5溶液配制（500mL） | |||
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| MES | 2mM | 0.19524 | KOH調(diào)pH5.7 |
| NaCl | 154mM | 4.49988 | |
| CaCl2·2H2O | 125mM | 9.18825 | |
| KCl | 5mM | 0.186375 | |
| MMG配制（100mL） | |||
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| MES | 4mM | 0.078096 | KOH調(diào)pH5.7 |
| D-Mannitol | 0.4M | 7.2868 | |
| MgCl2·6H2O | 15mM | 0.30495 | |
| PEG配制（10mL） | |||
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| PEG 4000 | 40% | 4 | |
| D-Mannitol | 0.2M | 0.36434 | |
| CaCl2·2H2O | 100mM | 0.14701 | |
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