實時熒光定量 PCR,簡稱 RT-QPCR, 屬于 Q-PCR 的一種,目前該技術(shù)已得
到廣泛應(yīng)用,如:擴增特異性分析、基因定量分析、基因分型、SNP 分析等。熒
光定量 PCR 常用的方法是 DNA 結(jié)合染料 SYBR GreenⅠ的非特異性方法和
Taqman 水解探針的特異性方法。
SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波
長的熒光染料,可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結(jié)合。在游離狀態(tài)下,
SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光,但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合,嵌入至 dsDNA,熒
光大大增強。
因此,SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān),PCR 擴增
不同時期中,dsDNA 含量不同,SYBR Green I 熒光信號強度不同??梢愿鶕?jù)熒
光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量,并可根據(jù)對照進行相關(guān)的計算
和分析。
實驗前準備
實驗開始前,需準備好實驗所需的各種試劑和耗材。
試劑包括:特異性 PCR 引物,新鮮提取備用的總 RNA。
使用的試劑盒有:用于合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor First
Strand cDNA Synthesis Kit,包含了 cDNA 反應(yīng)所需要的所有實驗組分以及相關(guān)
的正對照反應(yīng)組分。配套 LightCycler® 480 使用的試劑盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master,
包含了 PCR 所需的各種實驗組分,如 1 號管中包含熱啟動 Taq DNA Polymerase
及反應(yīng)緩沖液,dNTP mix,SYBR Green I 染料和 MgCl2
正式試驗開始前,冰上解凍各個試劑及試劑盒組分,置于冰上待用。注意:
SYBR Green I Master 需避光放置。
所需儀器與耗材有: LightCycler® 480 全自動實時定量 PCR 儀以及配
套使用的 96 或 384 多孔板,透明封板膜等一次性耗材。朗基T30 PCR 儀、rainin單道移液器、Nunc 冰盒及NEST 盒裝吸頭等。
實驗操作流程:
1.用新鮮提取的 RNA 反轉(zhuǎn) 錄合成 cDNA 第一鏈,然后進行實時熒光定量 PCR,其中包括:SYBR Green 反 應(yīng)體系的配置;PCR 程序設(shè)置;運行 PCR 實驗,樣品編輯和結(jié)果分析。
2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) :
反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈實驗操作時注意:所有 RNA 相關(guān)的操作均要佩戴手套,防止 RNase 污染。
相關(guān)操作嚴格按照試劑盒使用說明進行相關(guān)操作。
按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix,
總體系 13μl,本實驗是聯(lián)合使用 anchored oligo dT 引物和隨機六聚體引物進行
的反轉(zhuǎn)錄。先配置 NTC 對照,加入 9 號管水 10μl、 6 號管的 50mM oligo dT 引
物 1μl、5 號管的 0.6mM 隨機六聚體引物 2μl,混勻。然后進行樣品一號管的體
系配置,依次加入 1μl 已調(diào)整濃度的總 RNA、1μl oligo dT 引物、2μl 隨機六聚體
引物、最后加 9μl 水補充至總體積 13μl,混勻。其他樣品管,參照 1 號管的配置
方法,依次加好反應(yīng)體系。
注意:可將總RNA的模板量適當調(diào)整至 10ng-5μg,mRNA調(diào)整至 1-100ng。
若 RNA 樣品濃度較低,則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩(wěn)定模板 RNA。
將配好的反應(yīng) mix 在 PCR 儀中 65℃變性 10min,可有效減少 RNA 的二級
結(jié)構(gòu)。加熱后迅速置于冰上驟冷,放置 5min。
在反應(yīng) Template primer mix 中按體系配方順序,依次加入以下試劑:2 號管
的 5×反轉(zhuǎn)錄酶 buffer,4 號管 dNTP mix,3 號管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑,1 號
管 20 U/μl 的反轉(zhuǎn)錄酶,最終體積為 20μl。
若樣品數(shù)較多,先配置反應(yīng) mix 再分裝,小心吸打混合,切勿渦旋振蕩?;靹蚝笥谒矔r離心機上短暫離心,使樣品和反應(yīng)液落至離心管底部。
將離心管放置 PCR 中,根據(jù)使用的引物以及目標 mRNA 的片段長度進行程
序設(shè)置。本實驗反應(yīng)溫度和時間設(shè)置為:25℃,10min,55℃反應(yīng) 30min。反應(yīng)完畢后,于 85℃下加熱 5min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶,再置于冰上停止反應(yīng)。
此反應(yīng)產(chǎn)物可于 2-8℃存放 1-2h,或在-15 至-25℃下存放更長時間。
3. Q-PCR 擴增
cDNA 產(chǎn)物無需進行純化即可用于后續(xù)的 PCR 反應(yīng)。20μl 的 PCR 反應(yīng)體系
可取 2-5μl cDNA 反應(yīng)產(chǎn)物進行擴增。此試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄酶具有 RNase H 活性,
可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版,減少其對后續(xù) PCR 的影響。
本部分實驗,我們選用 SYBR Green I Master 試劑盒進行定量分析。
本實驗共設(shè)置 5 個標準樣品,包含 1 個標記為 0 的空白對照,5 個反轉(zhuǎn)錄樣
品,包含 NTC 對照,由于樣品數(shù)較多,先配制不含模版的總體系,再分裝為 10
管,加入各個樣品的模板后,再將每個樣品分裝為 3 個復孔。
按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix,10x Primer 上下游引物,
PCR 級別水??傮w系配好后,在用移液槍輕柔吸打均勻,然后分裝為 10 管,每
管 55μl。往 10 管中分別加入各個樣品對應(yīng)的調(diào)整好濃度的 cDNA。
STD 零加入 6μl 水代替模板,其余 STD 分別加入 6μl 已經(jīng)逐級稀釋好的標
樣模板。反轉(zhuǎn)錄樣品分別加入 6μl 濃度調(diào)整好的模板 DNA,包含 NTC?;靹颍?br/>然后將每個樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板,將多孔板
置于合適的離心機中 1500×g 配平離心 2min 將準備好的 96 孔板放置在 LightCycler® 480 設(shè)備中。
4.程序設(shè)定
雙擊打開 LightCycler® 480 的 1.5 軟件并登陸,自動進入軟件界面,點擊 new
experiment,在 Detection Format 選項中選擇 SYBR Green I 模式, 點擊 OK 完成檢
測通道的設(shè)定,
接下來設(shè)置反應(yīng)體積,對于 96 模塊,反應(yīng)體系為 10μl-100μl 之間,本實驗
是設(shè)定 20μl 的反應(yīng)體系。
在 Program Name 中輸入反應(yīng)名稱 pre incubation,預變性設(shè)定 1 個循環(huán),
無需進行熒光的收集,執(zhí)行的溫度和時間設(shè)定為 95℃ 10min,視圖會根據(jù)設(shè)定
進行實時的調(diào)整。點擊增加按鈕,輸入 Amplification,定義擴增循環(huán)的次數(shù)為 45 次,并選擇
熒光的收集功能 Quantification,然后設(shè)定 PCR 擴增循環(huán)的溫度與時間為 95℃ 10
s,點擊增加按鈕,設(shè)定退火溫度和時間為 60℃ 10s,以上兩步 Acquisition Mode
都默認選擇 None,繼續(xù)點擊增加按鈕,設(shè)置延伸溫度和時間為 72℃ 20s,
Acquisition Mode 選擇 Single,Ramp Rate 均按自動調(diào)整值,無需再設(shè)置。
設(shè)置溶解曲線,在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves,1 個循環(huán)
數(shù),Analysis Mode 選擇 Melting Curves,時間和溫度設(shè)置為 95℃ 5s,點擊增加
按鈕,新增設(shè)置溫度和時間為 65℃ 1min,以上兩步 Acquisition Mode 都默認選
擇 None。點擊增加按鈕,新增設(shè)置溫度為 95℃,Acquisition Mode 選擇 Continuous,,
其他設(shè)置無需改動。
設(shè)置保溫的過程 Cooling,只需 1 個循環(huán),無需收集熒光,設(shè)定溫度和時間
為 40℃、1min。設(shè)置完成后點擊右邊的保存按鈕保存設(shè)置的程序。此時整個 PCR
的循環(huán)體系、溫度的設(shè)置已經(jīng)設(shè)定完畢。
點擊 Start run 開始運行 PCR 反應(yīng),此時可在軟件上實時監(jiān)測樣品擴增情況。
5.樣品編輯
實驗結(jié)束,點擊 Sample Editor,進入樣本編輯區(qū)。
Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據(jù)樣本在板中排布的方式進行樣本編
輯。設(shè)置陰性對照、空白對照、標準品以及未知樣品等。
在 Select Sample 中,選中需要設(shè)置的樣品孔。在下一欄中的 Sample Name
輸入被選擇樣品組的名稱,并在 Sample Type 中選擇樣品組的類型,最后點擊
Make Replicates 設(shè)置復孔。標準品設(shè)置時,需填寫拷貝數(shù),只需填寫好稀釋倍數(shù),
初始濃度即可。編輯好樣品后,即可進行數(shù)據(jù)分析。如有需要,也可進行子集編
輯。
6.結(jié)果分析
樣品編輯好后,可進行實驗結(jié)果分析。
點擊左邊欄下方的 sum 按鈕,相應(yīng)出現(xiàn)實驗的所有信息,包括:設(shè)計的反
應(yīng)程序,實驗結(jié)果分析等。
點擊 analysis,可以根據(jù)樣品已有的數(shù)據(jù)進行細致準確地分析。點擊 Abs Quant second derivative max,彈出 create new analysis 窗口,在 Subset
選項中選擇分析樣品的分布區(qū)域,點擊確定,即可出現(xiàn)分析圖:相應(yīng)樣品的擴增
曲線。
Standard Curve 是根據(jù)標準品得出的標準曲線,曲線左側(cè)標有擴增效率、斜
率、截距、線性關(guān)系、以及錯誤率。一般“Error"值越小,說明實驗的準確率越高。
擴增效率如果越接近“2",說明這次的擴增反應(yīng)越好。
在數(shù)據(jù)表格,可顯示單個樣本的 Cp 值,以及相應(yīng)的樣本濃度值。
按復孔進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,顯示 Cp 平均值,方差,濃度的平均值以及方差。
蘇州阿爾法生物提供的實時熒光定量PCR儀、高速離心機、恒溫混勻儀、rainin移液器等試驗設(shè)備及1.5ml離心管、pcr管、酶標板等實驗耗材,廣泛用于熒光定量PCR實驗。