一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是,首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈,DNA樣品中,特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交,在dNTPs和Taq酶存在時(shí),就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈,反應(yīng)完成后,將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性,溫度下降后,過(guò)量的引物又可以開(kāi)始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次,使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
1. 變性:加熱使模板DNA在高溫下(94℃)變性,雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火:使溶液溫度降至50~60℃,模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合.
3. 延伸:溶液反應(yīng)溫度升至72℃,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導(dǎo)下,利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs),按5ˊ→3ˊ方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。
上述3步為一個(gè)循環(huán),即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講,每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,經(jīng)過(guò)25~30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106~109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成:DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTPs、MgCl2、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
三、 試劑和緩沖液
PCR mix,10×PCR Buffer,引物,模板。
四、 儀器耗材
PCR儀,掌上離心機(jī),微量移液器,槍頭,1.5mL離心管,PCR管,冰盒。
五、 實(shí)驗(yàn)步驟(每人一組,每人做1管,純化時(shí)兩人一組)
1. 查找基因序列,設(shè)計(jì)合成PCR引物。注意合成引物約需一周時(shí)間,請(qǐng)?zhí)崆皽?zhǔn)備。詳細(xì)步驟請(qǐng)參考實(shí)驗(yàn)一后面的附件內(nèi)容。
2. 在50μL反應(yīng)體系中,加入:
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2 (10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制,注意混勻后離心。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預(yù)變性94℃ 4min,然后循環(huán):94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 60s,30個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后,72℃10min 。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物4℃保存。(OC-II)
4. 取PCR產(chǎn)物2-5μL與上樣緩沖液混合,點(diǎn)樣。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳,160V 30-40min。
6. 電泳結(jié)束,溴化乙錠染色5-10分鐘。
7. 用凝膠成像儀觀(guān)察、拍照。
8. PCR產(chǎn)物切膠回收。步驟參見(jiàn)膠回收Kit說(shuō)明書(shū)。
A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。具體操作步驟如下,詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。
1)稱(chēng)回收的膠,每0.1g加100µL XP2 ;
2)55度5-7分鐘至溶膠 ;
3)取溶膠液加入回收柱子,最大體積700µL;10000g, 1min;
4) 加300µl XP2 ,10000g 1min;
5)加700µl SPW ,10000g 1min;
6)重復(fù)5);
7)空管離心2min,13000 g
8)干燥,加15-30µL Eulation Buffer
9)13000 g,1min
DNA產(chǎn)物純化kit,操作步驟:
將PCR反應(yīng)液(40ul)或酶促反應(yīng)液移至一干凈的1.5ml離心管中,加入5倍體積的buffer3,充分混勻。(用前確定加入適量的異丙醇)
將混合液全部移入吸附柱,8000g離心30s;將濾出液再次加入到吸附柱中再次過(guò)柱,8000g離心30s(此步驟可以提高回收效率);倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一收集管中。
向吸附柱中加入500ul Wash Solution(加到壁上),9000g離心30s。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一收集管中。(Wash Solution使用前請(qǐng)檢查是否已加入正確量的無(wú)水乙醇)
重復(fù)步驟3一次
將空吸附柱和收集管放入離心機(jī),9000g離心1min。下管扔掉,上管放入1.5ml離心管中,晾干。(殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗(yàn))
在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預(yù)熱(進(jìn)一步提高得率)的Elution Buffer(加到濾芯上),室溫靜置1min,9000g離心1min。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。注意:本步驟中,所有轉(zhuǎn)速單位為g。
B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對(duì)PCR產(chǎn)物回收。具體操作步驟如下。
加入等體積的冰無(wú)水乙醇,加入1/10體積的KAc(3M pH5.2)。
上下顛倒混勻,-20℃30min;12000r/min 4℃ 10min。
棄上清,加入70%的冰乙醇,輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min。
棄上清,室溫干燥,至無(wú)乙醇。
加入適量體積的ddH2O。六、注意事項(xiàng)
1. 進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí),注意加入試劑的順序。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實(shí)驗(yàn)使用2xPCR mix,包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀釋?zhuān)悍肿恿?4bp*324.5 = 7788,質(zhì)量數(shù)10OD*33 =33ug,摩爾數(shù)=33/7788 =4.2 nmol,母液濃度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L,使用時(shí)取母液稀釋5倍,則終濃度為10μmol/L。
4. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物共20μL,其中2-5 μL用于檢測(cè),剩余的用于純化回收。具體步驟參考 實(shí)驗(yàn)二C內(nèi)容。
5. 使用自己的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增的學(xué)生,請(qǐng)?zhí)崆皽?zhǔn)備引物和模板,并與任課教師協(xié)商。
思考題:
影響PCR反應(yīng)特異性的因素有哪些?請(qǐng)分析原因及解決辦法。
PCR引物設(shè)計(jì)的原則有哪些?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的PCR引物,并寫(xiě)到實(shí)驗(yàn)論文中。
附1:基因序列查找和PCR引物設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行之前,需要利用NCBI查找基因序列,并設(shè)計(jì)PCR引物。
進(jìn)入NCBI 后,在Search的下拉框中選擇Nucleotide,再輸入基因名稱(chēng),點(diǎn)擊Search即可。也可輸入具體的物種名以縮小范圍,獲得cDNA 序列信息。例如:水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因(Oryzacystatin, OC)序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA
引物設(shè)計(jì)。要求擴(kuò)增上述完整的cDNA 序列,并在兩端添加酶切位點(diǎn),5‘添加EcoRI(GAATTC), 3‘端添加HindIII (AAGCTT)。以便克隆到pET30a的相應(yīng)位點(diǎn)。注意PCR產(chǎn)物中沒(méi)有上述酶切位點(diǎn),否則不能使用。
prim-OC2-R GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC 26bp 下劃線(xiàn)為EcoRI識(shí)別序列
#prim-OC2-F GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC 26bp 下劃線(xiàn)為HindIII 識(shí)別序列
T載體通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
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